preloading
  1. صفحه اصلی
  2. دانستنی‌ها
  3. مقالات
  4. برتری استراتژی های تکثیر HPV بر اساس استفاده از نواحی E6/E7 نسبت به L1
 برتری استراتژی های تکثیر HPV بر اساس استفاده از نواحی E6/E7 نسبت به L1

برتری استراتژی های تکثیر HPV بر اساس استفاده از نواحی E6/E7 نسبت به L1

یکی از علل اصلی سرطان سرویکس عفونت با ساب تایپ‌های پرخطر HPV می‌باشد. یکی از رایج‌ترین روش‌ها برای تشخیص عفونت‌های ویروسی استفاده از روش‌های مبتنی بر PCR است. با استفاده از تکنیک PCR، 100–500-bp تکثیر می‌شود در حالیکه ژنوم HPV، 7.9 kb است و این بدان معنی است که نواحی بسیاری از ژنوم این ویروس می‌تواند به عنوان کاندید تکثیر در نظر گرفته شوند. اما آنچه اهمیت دارد این است که تفاوت در ویژگی‌های بیولوژیک و ویژگی‌های توالی موجود در نواحی مختلف ژنوم می‌تواند تأثیر حیاتی بر بازده PCR داشته باشد. در مقاله حاضر به بررسی مزایا و معایب تکثیر توالی‌های رایج در کیت های آزمایشگاهی موجود در بازار پرداخته شده است. 

نکات کلیدی:

  • E6/E7 جز نواحی انکوژنیک پاپیلوما ویروس است.
  • پس از عفونت سلول با ویروس HPV ناحیه E6 و E7 حفظ می‌شود در حالیکه ناحیه‌ L1 و E2 حذف می‌شود.
  • بر خلاف توالی ناحیه L1، توالی E6 و E7 کاملا حفاظت شده است.
  • تشابه بالا و یکپارچگی ناحیه E6 در هر ویروس HPV عاملی است که ریسک عدم اتصال صحیح پرایمر را کاهش می‌دهد.
  • توالی E6 و E7 بین گونه‌های مختلف پرخطر و کم‌خطر HPV متفاوت است در نتیجه امکان تشخیص افتراقی را فراهم می‌کند.
  • با توجه به تمام نکات گفته شده مشخص می‌شود که استفاده از توالی E6 و E7 انتخاب بهینه برای تشخیص HPV است.

ویژگی فیزیکی DNA HPV

ژنوم HPV دارای یک ناحیه تنظیمی بالادست یا ناحیه کنترل LCR، یک ناحیه برای ژن‌های بیان شونده اولیه (E1, E2, E6 and E7) و یک ناحیه برای ژن‌های تاخیری (L1 and L2. برخی از این نواحی باهم همپوشانی دارند به عنوان مثال ناحیه E6 که بلندتر از توالی ناحیه E7 است، در یک ناحیه قابل توجه با توالی E7 هم پوشانی دارد. پس از عفونت سلول‌های اپیتلیال سرویکس با ویروس، DNA حلقوی ویروس در سلول آزاد می‌شود.

در نمونه‌های کم خطر نظیر ساب تایپ‌های 6 و 11 ژنوم ویروس در سلول به صورت اپیزومال باقی می‌ماند، این حالت در نمونه‌های بالینی CIN1 ،CIN2 و گاها در CIN3 که دارای عفونت با ساب تایپ‌های پرخطر هستند نیز مشاهد می‌شود. با این وجود در سلول‌های سرطانی، اغلب مشاهده شده است که DNA ویروس در DNA سلول میزبان اینتگره شده است. دخول DNA ویروس در ژنوم میزبان عامل ترانسفورماسیون سلول و سرطانی شدن سلول است.

در طی فرآیند اینتگراسیون بخش بزرگی از ژنوم ویروس ازجمله ناحیه E2 ،E1 ،‌L1 و L2 حذف می‌شود. اهمیت این موضوع زمانی بیشتر مشخص می‌شود که هدف غربالگری افراد در معرض خطر برای سرطان سرویکس است چرا که در این سلول‌ها، فقط نواحی خاصی از ویروس که طی فرآیند اینتگراسیون حذف نشده‌اند، قابل شناسایی است.

چنانچه در مطالعات مختلف نشان داده شده است که اینتگره شدن و حذف توالی‌های ذکر شده در HPV16 در ۸۶٪ نمونه‌ها مشاهده شده است. قابل ذکر است که HPV16 نیز یکی از رایج‌ترین ساب تایپ‌ها در ایجاد سرطان سرویکس است بنابراین طراحی پرایمر برای تشخیص دقیق این ویروس و طراحی روش‌هایی با حساسیت بالا در تشخیص عفونت یکی از چالش‌های اصلی در این ارتباط است.

در کیت های آزمایشگاهی که از پرایمرL1 برای تشخیص HPV استفاده می‌کنند، نرخ نتایج مثبت بسیار کمتر از مقدار واقعی است و علت این نتایج منفی کاذب حذف توالی L1 طی فرآیند اینتگراسیون می‌باشد. از آن‌جایی که حذف توالی L1 نه تنها در فاز‌های تأخیری نئوپلازی بلکه در مراحل اولیه ایجاد ضایعه‌های سرطانی دیده می‌شود می‌توان به این نتیجه رسید که احتمالا این مرحله یکی از مراحل اصلی در سرطان‌زایی باشد.

علاوه بر این مطالعات اخیر نشان داده‌اند که برخی ساب تایپ‌های ویروس HPV نظیر 16، 18 و45 بسیار بیشتر از ساب تایپ‌های پر خطر 31 و 33 به حالت اینتگره در می‌آیند.

نواحی ژنومیک دخیل در فرایند اینتگراسیون

اینتگراسیون شامل ایجاد شکست در DNA و حذف قطعه‌ای از ژنوم ویروس است. بر اساس مطالعات انجام شده بر روی لاین سلولی سرطان سرویکس تغییراتی که در طی فرایند اینتگراسیون مشاهده شده است عبارتند از:

I. حذف یک ناحیه ۲-۳ کیلو بازی که شامل ناحیه E2 تا L2 است. 

II. امکان شناسایی رونوشت‌ها E6–E7 در سلول‌های آلوده. 

III. به هم ریختگی چارچوب خواندن کدون‌های ترجمه در توالی‌های E1 ,E2 ,E4 و E5 طی فرآیند اینتگراسیون در ژنوم میزبان. 

IV. با بررسی‌هایی که از طریق روش هیبریدیزاسیون با توالی‌های RNA انجام شد مشخص گردید که کل توالی E6 و E7 و بخشی از توالی E1 رونویسی شده است اما هیچ رونوشتی از نواحی L1 و L2 وجود ندارد که می‌تواند علت آن حذف این نواحی یا تغییر توالی آن‌ها به گونه‌ای باشد که امکان ایجاد رونوشت از آن‌ها وجود نداشته باشد.

علت اینتگراسیون ژنوم ویروس HPV

اینتگراسیون HPV16 DNA منجر به افزایش پایداری mRNA کد کننده E6 و E7 می‌شود و طی این فرآیند توالی‌های مربوطه از ناحیه غنی از AT جدا‌ شده و به ناحیه‌ای که غلظت کمتری از AT دارد متصل می‌شود و این تغییرات عامل افزایش بیان این پروتئین‌ها در سلول‌های سرطانی است.

جایگاه های موتاسیون در ژنوم HPV

یکی دیگر از نکاتی که در صورت استفاده از روش PCR در تشخیص HPV باید مد نظر قرار داد، سایت‌هایی است که احتمال وقوع جهش در آن‌ها بسیار زیاد است. یکی از این نواحی، L1 است و این ویژگی بر کیفیت اتصال پرایمر‌ها و نتیجه PCR اثر مستقیم دارد.

با بررسی‌هایی که بر روی رونوشت E6/E7 انجام شده، نشان داده شده است که توالی RNA دقیقا با توالی ثبت شده در داده پایگاه‌های علمی نظیر NCBI همخوانی دارد در حالیکه در HPVهایی که توالی L1 و E1 در آن‌ها حذف نشده است دارای انواع مختلف موتاسیون‌ها اعم از موتاسیون‌های Transversion، transition, small deletion, small insertion می‌باشد.

برخی از این جهش‌ها عبارت‌اند از:

• حذف سر 5`توالی L1 به صورتی که DNA باقی مانده از نوکلئوتید 6334 شروع شود
• حذف یک نوکلئوتید در ناحیه 6387
• دخول توالی CAT در موقعیت 6901
• حذف GAT در موقعیت 6949 


با توجه به این اطلاعات در ارتباط با روش شناسایی HPV کدام روش را باید انتخاب کنیم؟

مزیت هدف قرار دادن توالی‌های E1 و L1 توانایی آن‌ها در شناسایی بسیار و حتی تمام ساب تایپ‌های ویروس HPV است و عیب اصلی این نواحی این است که این توالی‌ها به احتمال بسیار بالا طی فرآیند اینتگراسیون یا حذف می‌شوند یا تغییرات ساختاری اساسی پیدا می‌کنند. از طرف دیگر هدف قرار دادن نواحی E6 و E7 تمام نمونه‌هایی که با ساب تایپ‌های پر خطر آلوده شده‌اند و ژنوم آن‌ها در ژنوم میزبان اینتگره شده است را شناسایی می‌کنند و در نتیجه استفاده از پرایمر برای این ناحیه باعث کاهش نرخ نتایج منفی کاذب می‌شود. استفاده از تکثیر توالی L1 در PCR با مشکلات اینتگراسیون و وقوع جهش‌های مختلف در این ناحیه همراه است، در نتیجه بسیاری از خانم‌های آلوده به پاپیلوما ویروس به دلیل عدم شناسایی از پروسه درمان حذف می‌شوند. در حالیکه این اتفاق به احتمال بسیار بسیار پایین‌تری در روش‌هایی که E6/E7 را هدف قرار داده‌اند رخ خواهد داد چرا که این نواحی جز نواحی بسیار حفاظت شده در ژنوم ویروس است و هر ‌گونه جهش و تغییر در این توالی باعث تغییرات اساسی در فعالیت ویروس از جمله فعالیت انکوژنیک خواهد شد.

مشکل دیگر استفاده از توالی L1 به کاربردن پرایمر‌های اختصاصی متعدد است.

تمام موارد ذکر شده نشان دهنده مزیت استفاده از پرایمر برای توالی E6/E7 نسبت به بقیه توالی‌هاست. جهت تأیید بر ادعا‌های ذکر شده نتایج چند مطالعه در این ارتباط بررسی می‌شود.

در مطالعه‌ای که بر روی سرطان آنال انجام شده است نشان داده شده که نرخ تشخیص عفونت HPV با استفاده از پرایمر L1 ،۱۶٪ و نرخ تشخیص در روش مبتنی بر استفاده از پرایمر E6 برابر ۴۶٪ بود.

روش مبتنی بر استفاده از پرایمر L1 اکثر نمونه‌های آلوده با ساب تایپ‌های 6 و 11 را شناسایی می‌کند اما نمونه‌های 16 و 18 را کمتر از تعداد نمونه‌های واقعی شناسایی می‌کند. در مطالعه دیگری نشان داده شده است که از ۵۶ نمونه در ۲۳ نمونه حذف توالی L1 ۴۱٪ اتفاق افتاده بود.

در مطالعه‌ای دیگر عملکرد پرایمر‌های E6/E7 با MY09/11 که از قطعه L1 است مقایسه شد و نتایج دو روش ۹۲٪ با هم همخوانی داشت اما یکی از نمونه‌ها که در روش MY09/11 منفی شده بود با روش E6/E7 مشخص شد که نمونه مثبت است.

در مطالعه‌ای دیگر نیز نشان داده شد که در مقایسه بین روش مبتنی بر استفاده از پرایمر E7 نسبت به استفاده از پرایمر‌های تغییر یافته L1(Nested primers (MY11/GP6q and GP5q/ GP6q) حساسیت بیشتر و نرخ تشخیص بالاتری دارد.

مقالات مرتبط

نمایندگی انحصاری برترین برندهای تجهیزات پزشکی و کیت‌ های آزمایشگاهی